产品目录

本试剂盒是一种非常便捷和高效的通过酶学方法将单链DNA 5'端腺苷酰化修饰的试剂盒。试剂盒中的Adenylase来源为嗜热古细菌，在大肠杆菌中进行表达而获得。

本试剂盒制备产生的5'端腺苷酰化修饰的单链DNA，常用于miRNA等3'端为羟基的RNA或3'端为羟基的单链DNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3'端添加的接头。

本试剂盒进行腺苷酰化修饰反应时，需要腺苷酰化酶(Adenylase)、ATP和待腺苷酰化修饰的5'端磷酸化的单链DNA。

本试剂盒腺苷酰化修饰效率高，通常可以达到95%以上。对5'端磷酸化的单链DNA进行腺苷酰化修饰反应时，无论该单链DNA的3'端是否进行了氨基化等封闭都可以得到高产量的腺苷酰化产物。通常本试剂盒能将95%以上的5'端磷酸化的DNA (pDNA)转化成腺苷酰化DNA (AppDNA)，因此腺苷酰化的产物通常不需要进行电泳切胶回收，可以直接通常乙醇沉淀进行进一步浓缩后用于后续的连接反应。

本试剂盒以5'端磷酸化的单链DNA为底物，腺苷酰化酶将ATP分解成AMP和PPi，AMP转移到单链DNA的5'磷酸基团上，形成腺苷酰化单链DNA，从而制备出腺苷酰化接头(linker)。

本试剂盒也可以用于5'端磷酸化的单链RNA的5'端腺苷酰化修饰，可根据具体应用选择合适的实验步骤，同时需要额外准备RNase抑制剂(货号：YT530)和DEPC水(货号：YT528)等。

使用本试剂盒单步反应即可完成5'端磷酸化修饰的单链DNA或RNA的腺苷酰化修饰，与传统的化学方法相比较，更加简便；对于底物转化效率高达95%以上，无需切胶纯化仅需酒精沉淀等即可用于后续反应；在65℃这样一个较高的温度反应，可以有效避免二级结构对于5'端腺苷酰化修饰反应的干扰；适用于pmol级别底物量的反应体系，也可以很方便地放大至μmol级别底物量的反应体系。

组分	10T	50T
Adenylase	20μL	100μL
10×Adenylation Reaction Buffer	25μL	125μL
ATP(1mM)	25μL	125μL

保存：-20℃，有效期1年。

• 底物单链DNA或单链RNA的5'端磷酸化是必须的，3'端可以进行氨基化等封闭，也可以不封闭。
  
• 本试剂盒提供的腺苷酰化反应体系可以按比例放大反应体系，对腺苷酰化产物的得率无显著影响。
  
• 本试剂盒提供的Adenylase的最佳反应温度为65℃，并且在25℃时会出现去腺苷酰化现象，因此反应完成后推荐在85℃孵育5min以失活Adenylase。如果没有失活Adenylase，后续经历室温温度条件时，会导致腺苷酰化比率下降。

本试剂盒催化5'端磷酸化单链DNA生成5'端腺苷酰化修饰单链DNA的效果参见图1。

图1．使用本试剂盒制备5'端腺苷酰化修饰单链DNA的效果图。反应体系为20μL，单链DNA的终浓度为5μM，反应条件为65℃分别孵育15、30、45、60和90min，反应完毕后85℃孵育5min终止反应。电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴以充分变性，尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。如图所示，本试剂盒在15min内就可以将大部分5’端磷酸化单链DNA(pDNA)催化生成腺苷酰化的单链DNA (AppDNA)，孵育60min可以确保将95%以上的底物转化成腺苷酰化修饰的单链DNA。


磷酸化的ssDNA序列5'端腺苷酰化：

• 解冻5'端腺苷酰化修饰反应所需的各种试剂，将Adenylase置于冰浴上或冰盒内。
  
• 参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  Water(DNase-free或DEPC-treated)	13μL	-
  ssDNA或ssRNA(100μM)	1μL	5μM
  10×Adenylation Reaction Buffer	2μL	1×
  ATP(1mM)	2μL	0.1mM
  Adenylase	2μL	-
  总体积	20μL	-

  
  注意：
  
  • 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
    
  • 如果涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DECP处理去除RNase或者确保是RNase free的。如果涉及单链RNA，推荐适量添加RNase抑制剂(货号：YT530)。
• 腺苷酰化反应：65℃孵育1h。个别情况为了使连接反应更加充分，可以适当延长反应时间。
  
• 终止反应：85℃孵育5min。
  
• 腺苷酰化产物的电泳鉴定：电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴，以充分变性。尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。腺苷酰化修饰后分子量会变大一点(参考图1)。
  
• 浓缩及后续用途：可以采用常规的乙醇沉淀方法进行浓缩，后续可以使用T4 RNA连接酶II(截短型)(货号：YTB4028)等用于和小RNA等的3'羟基的连接反应。

• 腺苷酰化反应不完全或反应产物非常少。
  
  • 用于制备腺苷酰化接头时出现反应不完全的情况，建议可适当延长反应时间至2h甚至过夜。
    
  • 在不改变底物量的前提下适当增加酶量，或在不改变酶量的前提下适当减少底物量。
    
  • 当底物为ssRNA时，可能会出现ssRNA降解的情况，建议使用RNase Free的水及耗材。
    
  • 电泳条带不清晰或弥散，建议用尿素(7M)变性聚丙烯酰胺(15%)凝胶；当底物为ssDNA时，建议电泳条件为180V，50～60min；当底物为ssRNA时，建议电泳条件为50～60V，20～30min；若上样前用电泳液冲洗上样孔中的尿素，会得到更理想的电泳条带。
    
  • 放大体系在65℃水浴锅中进行反应时，反应进行1h或更长时间时，会明显观察到有白色沉淀出现，这是Adenylase沉淀所致，这时通常底物已反应完全，所以酶的析出不会对产物的得率产生显著影响。

相关搜索：5'DNA腺苷酰化试剂盒，DNA腺苷酰化试剂盒，5'DNA Adenylation Kit